Hepburn egyes források szerint 1907 május 12-én született. Egy gyermekkori trauma után (játék közben a bátyja véletlenül felakasztotta magát és Katherine szeme láttára halt meg) azonban sokáig a bátyja születésnapját, november 8-át használta sajátjaként. Iskolái elvégzése után egy baltimore-i társulathoz szegődött, de a karakteres arcú színésznőt hamar felfedezte a szakma. Színházi pályafutását a Broadway-en folytatta, majd egy átütő sikerű alakítása után (1932-ben az amazonhercegnőt játszotta a Harcos felesége című kosztümös darabban) kapta első hollywood-i ajánlatát.

1932 és 1934 között öt filmben szerepelt, az 1933-as Hajnalká-ért (MorningGlory) pedig megkapta első Oscar-díját, amit az évek során még három követett. 1968-ban a Találd ki, ki jön vacsorára (Guess, Who's Coming to Dinner), 1969-ben Az oroszlán télen (The Lion in Winter), 1982-ben pedig Az aranytónál (On Golden Pond) című filmekért vehette át az aranyszobrocskát. Ezzel a négy díjjal a mai napig a legtöbb Oscarral jutalmazott színésznő.

Több évtizedes pályafutása során majd minden zsánerben kipróbálta magát. Játszott történelmi drámában éppúgy (Az oroszlán télen), mint romantikus komédiában (Philadelphiai történet). Védjegyévé mégis az erős, független akaratú női karakterek megformálása vált.

Mások mellett James Stewart, Humphrey Bogart, John Wayne, Henry Fonda partnereként jegyzi őt a filmtörténet, nevét azonban leginkább Spencer Tracyével párosítják, akivel egy életen át tartó szerelmi kapcsolata volt.

Halálának pontos okát még nem állapították meg, a Reuters hírügynökség szerint elhunytát valószínűleg idős kora magyarázza. A színésznő a kilencvenes évek elejétől Parkinson-kórban szenvedett és visszavonultan élt connecticuti birtokán.